蛋白質(zhì)是與生命及各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)是由不同氨基酸以肽鍵相連所組成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)可分為以下4個(gè)結(jié)構(gòu)層次：
圖1 蛋白質(zhì)的四個(gè)結(jié)構(gòu)層次
我們所關(guān)注的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)指的是蛋白質(zhì)分子局部區(qū)域內(nèi)，多肽鏈沿一定方向盤繞和折疊的方式，主要是分子內(nèi)的氫鍵維系的局部空間排列，包括α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲等。
常見(jiàn)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的方法有四種：紅外光譜法、X射線衍射法、圓二色譜法和熒光光譜法，其中紅外光譜法的優(yōu)勢(shì)非常明顯，可以宏觀整體的鑒定復(fù)雜體系，測(cè)定不同狀態(tài)、不同濃度和不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)和多肽，而且紅外光譜法是一種快速的無(wú)損檢測(cè)方法。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）法應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的定性和定量分析已有幾十年的歷史，是一種非常成熟的檢測(cè)方法，人們對(duì)各類蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)紅外吸收峰，以及同類蛋白質(zhì)不同組分的特種頻率和指認(rèn)，都已非常明確，如下表所示。目前，蛋白質(zhì)紅外檢測(cè)方法已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量控制和出廠檢測(cè)中。
表1 各類蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)紅外吸收峰
根據(jù)樣品的形態(tài)不同，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的紅外測(cè)試方法分為兩種：
1、液體樣品
常用配置為紅外光譜儀主機(jī)配套液體池附件和專門的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件，還可以根據(jù)測(cè)試需要增加溫度控制系統(tǒng)，如下圖所示。
圖2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)
紅外液體池及溫控裝置
2、固體樣品
常用配置為紅外光譜儀主機(jī)配套壓片機(jī)、衰減全反射（ATR）附件和測(cè)試軟件，含分峰、差減、求導(dǎo)、卷積、去卷積、曲線擬合等功能，或可根據(jù)測(cè)試需要配套帶溫控功能的ATR附件。
FTIR用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析實(shí)例已經(jīng)非常多，不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性定量分析，如注射用人免疫球蛋白的檢測(cè)，也可以對(duì)由溫度、化學(xué)、物理和癌變等因素導(dǎo)致的變性蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，下面力晶小天為大家舉幾個(gè)“栗子”：
人工抗原的鑒定
衰減全反射紅外光譜法可以實(shí)現(xiàn)原位測(cè)定和實(shí)時(shí)跟蹤，對(duì)于需要觀察過(guò)程反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)具有很高的利用價(jià)值。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)酰胺吸收帶的二階求導(dǎo)和去卷積等，可以觀察蛋白質(zhì)分子部分或全部去折疊引起的二級(jí)機(jī)構(gòu)的破壞以及相對(duì)含量的變化。對(duì)此，浙江農(nóng)林大學(xué)化學(xué)系的郭明等人合成致癌物氨基甲酸乙酯的人工抗原后，通過(guò)衰減全反射紅外光譜成功地對(duì)人工抗原蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及其含量進(jìn)行了分析。利用FTIR對(duì)人工抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的應(yīng)用很多，方法也非常成熟，除了ATR法，液體池法和壓片法也經(jīng)常被采用。
過(guò)敏原原肌球蛋白檢測(cè)
水產(chǎn)品中，蝦蟹(甲殼)類和貝類為水產(chǎn)品的主要致敏食物，而原肌球蛋白是其中主要的過(guò)敏原，其引起的過(guò)敏癥狀日趨復(fù)雜和嚴(yán)重。而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中，質(zhì)譜技術(shù)的儀器成本和操作要求高，并且用SDS電泳分離蛋白導(dǎo)致蛋白變性，對(duì)被檢食品樣品有損害；PCR檢測(cè)技術(shù)用來(lái)檢測(cè)加工食品可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、膠體金試紙條檢測(cè)、磁性免疫層析法及生物傳感器檢測(cè)法等步驟繁瑣且都需要抗體。上海海洋大學(xué)的盧瑛等人發(fā)明了紅外衰減全反射法快速鑒定和檢測(cè)過(guò)敏原原肌球蛋白。
圖3 不同水產(chǎn)品的光譜
癌癥早期診斷
隨著FTIR技術(shù)的不斷進(jìn)步，為癌癥的早期診斷提供了可能，針對(duì)這方面的報(bào)道也越來(lái)越多。例如，原發(fā)性膽囊癌細(xì)胞缺乏典型的臨床表現(xiàn)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)屬中晚期，術(shù)后5年生存率不到5%。而早期原發(fā)性膽囊癌術(shù)后5年生存率可達(dá)100%，早期診斷是提高療效、改善預(yù)后的關(guān)鍵。西安交大醫(yī)學(xué)院diyi附屬醫(yī)院普外科的孫學(xué)軍等人通過(guò)賽默飛世爾的紅外光譜儀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膽囊癌組織與正常膽囊組織的紅外光譜具有顯著差異，可作為癌癥早期診斷的手段。
中科院同步輻射實(shí)驗(yàn)室的馬曉冬等人認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞和組織樣品取樣較為不便，所以根據(jù)中醫(yī)理論——人的指甲在一定程度可以反映出內(nèi)臟器官的生理病理變化，建立了通過(guò)指甲紅外光譜判斷消化道癌的方法。之前還有人通過(guò)指甲的紅外光譜，對(duì)鼻咽癌進(jìn)行早期診斷。
結(jié)直腸癌化療療效的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)
在結(jié)直腸癌的化療中，常采用5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。臨床上對(duì)放化療效果的監(jiān)測(cè)主要是通過(guò)電子顯微結(jié)腸鏡、CT和B超等手段，只是在組織水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而組織變化之前腫瘤細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)成早已發(fā)生改變，尚未出現(xiàn)臨床癥狀和影像學(xué)改變。西安交大醫(yī)學(xué)院diyi附屬醫(yī)院普外科的劉棟等人利用賽默飛世爾的iN10 MX型顯微紅外光譜儀，對(duì)不同時(shí)期腫瘤細(xì)胞中的脂類、氨基酸殘基、DNA和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行檢測(cè)，研究出實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)腫瘤化療療效的有效方法。
圖4 隨凋亡時(shí)間延長(zhǎng)蛋白質(zhì)α螺旋和NH二級(jí)結(jié)構(gòu)吸收峰強(qiáng)降低，
提示細(xì)胞α螺旋解鏈，細(xì)胞凋亡（a: Control; b: 12h; c: 24h; d: 48h）
不同制備條件對(duì)抗體蛋白的影響
免疫膠乳指特定抗體或抗原固定于膠乳顆粒表面形成具有免疫學(xué)性質(zhì)的膠乳顆粒。傳統(tǒng)物理吸附法固定大分子蛋白容易脫落，用共價(jià)偶聯(lián)的方法制備免疫膠乳，蛋白質(zhì)在吸附于膠乳顆粒表面的過(guò)程中結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，不同偶聯(lián)條件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不同。華南理工大學(xué)的俞思明等人利用壓片法測(cè)得免疫膠乳的紅外透射光譜，并結(jié)合多種算法，分析了不同條件下共價(jià)偶聯(lián)對(duì)抗體蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。
隨著FTIR軟件和硬件技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信未來(lái)紅外光譜法在蛋白質(zhì)檢測(cè)各領(lǐng)域中的應(yīng)用也會(huì)更加普遍，同時(shí)將由離體分析蛋白質(zhì)向在體分析方向發(fā)展，這對(duì)化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都將具有重大意義。
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